多次培养均呈阴性,河水洗脸终致眼球摘除

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龚路

华中科技大学同医院检验科

徐玲娟

华中科技大学同医院眼科

前言

病原微生物感染是引起角膜炎的最常见原因，病原微生物包括细菌（如肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、绿脓杆菌、淋球菌等）、病毒（单纯疱疹病毒、腺病毒等）、真菌、棘阿米巴原虫、支原体、衣原体、梅毒螺旋体等。

通常是在合并角膜上皮细胞的损伤、脱落或机体抵抗力下降时才致病。角膜上皮遭受损伤后极容易发生感染性炎症。因此角膜异物、角膜擦伤、不正确使用角膜接触镜、眼部接触污染的药物或水源等是感染性角膜炎的常见易感因素，糖尿病、营养不良、慢性消耗性疾病患者，也会因抵抗力下降而易患角膜炎。

内腐霉是一种卵子菌，是一种类似真菌的有机体，其菌丝发育类似于真菌[1]，因此内腐霉角膜炎常常因缺乏特征性的临床特点被误认为真菌感染，然而常规抗真菌治疗无效，导致缺乏早期诊断使病情延误甚至眼球摘除。本文分享一例引起角膜感染的内腐霉的鉴定过程。

案例经过

年9月，55岁男性，用污染河水洗脸，三天后左眼刺激、异物感、疼痛及视力减退。前往当地眼科诊所就诊，诊断为“病毒性角膜炎”。予以抗病毒，促进角膜修复治疗后无好转，改用抗真菌等治疗，患者症状无改善，且病情逐渐加重，患者转诊我院。

入院检查：右眼鼻侧结膜肥厚，向角膜浸润性生长，侵及角膜约2mm，余角膜清，前房深度可，周边前房深度（PACD）约1个角膜厚度（CT），闪辉（-），虹膜纹理清，瞳孔圆，直径约2mm，对光反射可，晶体轻度混浊。左眼混合性充血，鼻侧可见显微血管组织向角膜浸润性生长，越过角膜缘约2.5mm，中央偏鼻侧可见直径约5mm不规则角膜白色浸润，余角膜雾状水肿，前房深度可，余窥不清。（图1A,B,C,D）

图1

入院第1天，眼部分泌物送检：革兰氏染色、KOH压片、细菌及真菌培养均呈阴性。给患者经验用药以抗局部和全身感染，包括奥硝唑、妥布霉素、万古霉素、纳他霉素和氟康唑。

入院第3天，症状无改善，行“左眼翼状胬肉切除+自体角膜缘干细胞移植术+穿透性角膜移植术”，术后细菌、真菌培养和阿米巴检查仍呈阴性。治疗同前，并加用洗必泰抗阿米巴治疗。

术后12天，角膜植片水肿，植片与植床相接处可见灰白色浸润灶。晶体混浊，下方前房可见粘稠积脓，考虑感染复发。行“左眼全角膜穿透性移植术”，对症治疗同前。

第二次手术后10天，感染扩散至邻近巩膜，合并前房积脓，考虑眼内炎。行“右眼眼内容物剜除术”。术中角膜组织直接点种（血平皿），几天后可见有膜状菌落生长（图2）。

图2血平皿上菌落形态

使用多种鉴定方法，包括转种马铃薯葡糖糖琼脂培养基（PDA）（见图3），乳酸酚棉兰染色后显微镜镜检见图4、MALDI-TOF-MS质谱分析（质谱分析图见图5）、ITS测序，最终鉴定为内腐霉菌（Pythiuminsidiosum）。其中MALDI-TOF-MS质谱分析时未能与数据库中质谱分析图进行匹配，根据ITS测序结果进行了自建库。

图3，PDA培养基平皿上菌落形态，呈放射状生长,气生菌丝低矮外观似膜状

图4显微镜乳酸酚棉兰染色形态（×），菌丝稀疏分隔，有垂直的侧枝

图5质谱分析图

临床案例分析

（一）为何抗真菌治疗无效?

此患者反复使用多种抗真菌药物（纳他霉素、氟康唑、伏立康唑、两性霉素B）治疗，症状均未有所缓解。

内腐霉性角膜炎常被误诊为真菌性角膜炎而使用抗真菌治疗，但由于内腐霉其细胞质膜缺少麦角固醇[2]，其细胞结构与真菌不同。而大多数常用的抗真菌药物都是针对麦角固醇生物合成中必需的关键酶设计的抑制剂，其通过竞争性地与关键酶结合，抑制麦角固醇合成，使真菌的细胞膜受到破坏，从而抑制真菌的生长繁殖。所以抗真菌治疗对内腐霉无效。

检验案例分析

(二)为什么多次培养均呈阴性，而眼球摘除后为阳性？

患者前几次培养送检标本均为分泌物，而眼球摘除术后为角膜组织直接床旁点种血平皿。第一考虑分泌物标本量是否足够，第二考虑标本运送时间是否过长导致致病菌已死亡。

本病例最终通过角膜组织床旁接种培养出致病菌，提示及时的床旁接种可以大大提高致病菌检出的阳性率。

（三）为何要自建质谱数据库？

对该菌株鉴定时使用Bruker-MALDI-TOF-MS质谱分析，分析结果可见三个特征性的蛋白峰，但是无匹配的结果，是因为数据库中缺少这种少见菌的标准图谱，无法匹配结果。对于这些比较有意义和比较有代表性的少见菌株，其鉴定较为很难，利用测序结果和质谱蛋白结果相结合，通过Bruker-MALDI-TOF-MS的标准建库流程，将此图谱添加到自己数据库，可以帮助今后再分离到该菌时利用Bruker-MALDI-TOF-MS质谱进行快速鉴定。

知识拓展

1.内腐霉性角膜炎常见临床特点

①疑似与接触污水相关的角化真菌病

②抗真菌治疗无效

③菌落呈放射状生长,气生菌丝低矮外观似膜状；镜下菌丝稀疏分隔，有垂直的侧枝

2.如何提高培养阳性率

①送检更有价值的标本

②及时快速接种标本如床旁接种

3.内腐霉治疗

①利奈唑胺、阿奇霉素联合硫酸阿托品对内腐霉角膜炎有一定疗效[3,4]

②四环素，大环内酯类和利奈唑胺支持用于体外腐霉菌感染的治疗[2]

③由米诺环素，利奈唑胺和氯霉素组成的三联疗法可能是治疗腐霉病的可行治疗方案[5]

病例总结

因为对内腐霉的不熟悉，该患者被误诊为真菌性角膜炎，长时间抗真菌治疗未见明显改善，且感染情况持续加重，最终执行眼球摘除术缓解病痛。经过多种方法的选择和鉴定，最终找到致病菌。自建数据库有助于实验室对今后此菌的鉴定。

专家点评

内腐霉性角膜炎常被误诊为真菌性角膜炎，但应用抗真菌治疗无效，该类病原体应该考虑疑似与接触污水相关的角化真菌病。测序技术和MALDI-TOF-MS方法的联合应用有助于早期诊断疾病的症状。此外，针对该菌的抗菌治疗方案还有待进一步研究。

（点评专家：陈中举，华中科技大学同医院检验科，副主任技师）

参考文献：

[1].KrajaejunT,SathapatayavongsB,PracharktamRetal:ClinicalandepidemiologicalanalysesofhumanpythiosisinThailand.ClinInfectDis;43(5):-.doi:10./

.

[2].RamappaM,NagpalR,SharmaSetal:SuccessfulMedicalManagementofPresumptivePythiuminsidiosumKeratitis.Cornea;36(4):-.doi:10./ICO.

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[3].BaggaB,SharmaS,MadhuriGudaSJetal:LeapforwardinthetreatmentofPythiuminsidiosumkeratitis.BrJOphthalmol;(12):-.doi:10./bjophthalmol--30

.

[4].LoretoES,MarioDA,DenardiLBetal:InvitrosusceptibilityofPythiuminsidiosumtomacrolidesandtetracyclineantibiotics.AntimicrobAgentsChemother;55(7):-.doi:10./AAC.-10

.

[5].MaenoS,OieY,SunadaAetal:SuccessfulmedicalmanagementofPythiuminsidiosumkeratitisusinga